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        細胞凍存的一般方法

        點擊次數:526 發布時間:2016-09-07

        細胞凍存的一般方法  
        開始細胞凍存前,仔細檢查細胞凍存所需的儀器和試劑是否齊全:一般主要有:傳代細胞單層、適宜生長液、滅活小牛血清、慶大霉素溶液、7.5%NaHC03溶液、0.25%胰蛋白酶溶液、標簽用具:100ml方瓶(培養細胞用)、克氏瓶、紅翻帽塞、吸管(10ml、lml)、細胞凍存管、二甲基亞砜、CO2孵箱、超掙臺、倒置顯微鏡、2~8℃冰箱、-20℃冰箱、液氮罐
        操作步驟
        鏡檢細胞,挑選培養3~4天的細胞,生長狀態良好,無污染、異常及可疑病變細胞。配制細胞培養液:根據不同的細胞需用不同的基礎液,培養液配方為(基礎液:7.5%碳酸氫鈉:1萬單位慶大霉素=100:1:0.25)。制備細胞懸液:挑選培養3—4天的細胞,細胞界限清晰,具有立體感,細胞形態良好的單層細胞瓶,棄去培養液,先用PBS洗液沖洗細胞表面1-2次,再向克氏瓶中加入0.25%胰酶8ml,等細胞面開始出現裂縫時倒掉瓶中部分胰酶,大克氏瓶中保留2 ml,放置幾分鐘使細胞完全脫落到胰酶中,收集含細胞的胰酶,并用培養液沖洗細胞瓶3-4次,收集沖洗液;向收集液中補加以下物質:小牛血清使終濃度為20%、二甲基亞砜使終濃度為9%;分裝:將細胞懸液混勻后,立即分裝于細胞凍存管中,每管按1~1.6ml的量分裝,擰緊管蓋;在凍存管上做好標記,包括細胞代號及凍存日期等。
        凍存
        先將凍存管放入普通冰箱冷藏室(2~8℃),約3-4h;接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室,約3-4 h;然后將凍存管放置液氮灌口,過夜;zui后將凍存管投入液氮保存。記錄:記錄內容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。

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